多聚甲醛固定，確實是老生長談，很多研討生在做實驗時，可能很多師兄師姐都讓他們用多聚甲醛固定，有些可能是為了長時間保管樣本，希望集中起來染色，有些可能是染色后排不上隊，想堅持長時間質(zhì)量穩(wěn)定。于是就這么口口相傳下來了。

預(yù)固定問題

做科研或臨床時，可能很多FLOWER習(xí)氣性都會用4％多聚甲醛預(yù)先固定標(biāo)本，可能出于三個目的： （1）為了滅活標(biāo)本里面可能存在的微生物（細菌、病毒等），起到安全保證作用。 （2）希望標(biāo)本能夠較長時間存放 （3）做胞內(nèi)染色前的準(zhǔn)備。 但是，可能很多人忽視了一點，就是假設(shè)在染色之前用多聚甲醛固定標(biāo)本，細胞表面有些位點在固定后構(gòu)象發(fā)作改動，使得抗體無法別離產(chǎn)生假陰性，也可能由于固定作用，招致其它位點產(chǎn)生非特異性別離（假陽性）。

因此，知道哪些抗體染色前不能預(yù)固定貼心的技術(shù)人員曾經(jīng)幫我們做了一系列測試，下面兩張表，一張是人類抗原，一張是小鼠抗原，可以看的出來，大多數(shù)不能做預(yù)固定的抗體都是趨化因子受體，所以，大家在實驗中千萬要留意不要先固定后染色。

表1、4％多聚甲醛預(yù)固定對各種抗體表面染色的影響（人類），打勾的為允許預(yù)固定，打叉的表示預(yù)固定影響很大

表2、4％多聚甲醛預(yù)固定對各種抗體表面染色的影響（小鼠），打勾的為允許預(yù)固定，打叉的表示預(yù)固定影響很大

染色后固定問題

染色后的固定，就與抗原構(gòu)象關(guān)系不大了，更多的是熒光素。以前4色以內(nèi)的時分，用的熒光素都是非串聯(lián)的，因此大多數(shù)影響不大，但隨著各種新型串聯(lián)染料的呈現(xiàn)，多聚甲醛固定就成了問題了。

事實上，當(dāng)你去搜索串聯(lián)染色標(biāo)志（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗體時，會發(fā)現(xiàn)一些比較細致的描畫里面會注明（以BD網(wǎng)站搜索APC-cy7各類抗體為例）：

Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.

意義就是用多聚甲醛固定過的樣本，必需在4小時內(nèi)檢測，否則容易招致串聯(lián)染料降解，若要長時間保管，還是需求洗濯后，轉(zhuǎn)移到不含多聚甲醛的緩沖液中。

需求留意的是，做GFP熒光檢測的同窗，也需求留意一下，多聚甲醛固定也會影響GFP，New York Medical College的Paul A Lucas以為是由于多聚甲醛固定后，并非使GFP熒光淬滅，而是使GFP蛋白構(gòu)象發(fā)作改動，無法產(chǎn)生熒光。有時分你固定后檢測到的熒光可能是自發(fā)熒光，或剩余的未被改動構(gòu)象的GFP發(fā)出的。

處方案

1、假設(shè)檢測的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子，請盡量不要預(yù)固定，如需長期保管樣本，可以思索凍存單個核細胞。

2、假設(shè)檢測的是前述表格中不會受多聚甲醛影響的分子，可用1％多聚甲醛預(yù)固定保管，但FSC、SSC和熒光強度影響較大，如需避免此類缺陷，可思索流式中文網(wǎng)研發(fā)的細胞保管液。流式中文網(wǎng)的細胞保管液不含多聚甲醛，具有緩釋輕柔的固定作用，故保管更耐久，效果更佳，樣本：保管液＝6：1～10：1，21～28天內(nèi)檢測均可獲得良好的檢測結(jié)果。

3、假設(shè)希望在染色后堅持較長時間熒光穩(wěn)定，仍首選建議：避光、4度，在我們非正式的10色（BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7）流式檢測時，曾經(jīng)測過數(shù)例，在避光、4度保管24小時后，熒光強度幾乎無變化，細胞分群良好。  假設(shè)仍不放心，可思索置辦商品化的適用于串聯(lián)染料的專用固定劑。

 

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